DNA突变是癌症诊断的重要生物标志物，在癌症的早期识别和转移监测中发挥着关键作用，尤其是低频突变。在FDA批准的突变检测试剂中，124种被指定用于组织活检，47种用于液体活检，组织样本仍然是检测DNA突变的主要依据。但由于肿瘤异质性高，对于低变异等位基因频率（VAF）的样品，需要检测灵敏度高的方法来避免假阴性结果。另一方面，人类基因组中存在3.1%的突变热点和0.2%的热点簇，如KRAS（外显子2~4）和TP53（外显子5~8）、EGFR和BRAF基因。这些热点和热点簇与癌症的发生、进展和患者生存有关。例如，BRAF基因突变热点簇的患者生存率较高，而TP53和EGFR基突变热点的患者生存率较差。因此，开发能够检测热点区域低频突变的方法至关重要。

　　研究者构建了一种长抑制探针置换扩增技术（Long Blocker Displacement Amplification, LBDA）实现了针对组织样本中肿瘤热点突变的高灵敏、高通量检测。该技术基于核酸杂交热力学能的精准调控，利用正向引物和抑制探针之间的链置换反应，并探究了影响杂交热力学能的因素包括温度、盐浓度等，实现对突变位点放大检测区间较常规抑制探针扩增技术高2倍，从而获得了可以实现单重探针单管同时检测81个不同的核酸突变，检测限最低可以达到0.01%。

　　团队首先探索了针对特定核苷酸设计的单个Long Blocker的抑制能力及其对各种突变类型的富集能力。将rs10508599 (T)的合成DNA模板定义为野生型模板（WT），将三种类型的突变(G、C、A)定义为突变型模板（MT），并根据WT序列设计长阻断剂。

　　根据实验结果，LBDA可以在一次反应中检测到低至0.5%变异等位基因频率(VAF)的不同突变类型，与野生型相比，21个突变DNA模板的中位富集倍数为1000倍。LBDA能够在富集区富集所有与WT序列不同的变异。

　　根据国际癌症研究机构(IRAC)的报告，结直肠癌是全球第三大流行癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。KRAS和NRAS突变在结直肠癌中很常见，经常发生在突变热点。

　　因此研究者利用LBDA-qPCR检测KRAS和NRAS突变热点，利用单条Long Blocker能够覆盖81个突变类型（数据参考COSMIC），在合成模板和结直肠癌组织样本中分别进行了测试。此外，通过Sanger测序验证突变类型，与下一代测序结果一致。

　　本研究中LBDA-qPCR方法是检测癌症中低频突变的一种有效而灵敏的工具，特别是可以富集突变热点簇的区域。实验中单个Long Blocker可以富集高达44 nt的各种突变类型，同时仅用20 ng DNA输入即可实现10,000倍的突变富集。研究者设计用于检测KRAS和NRAS突变的LBDA-qPCR。在临床样本中测试的结果揭示了结直肠癌组织中肿瘤的异质性，以及组织与血液样本之间的异质性。总之，LBDA-qPCR具有高通用性和高灵敏度，是一种全面、灵敏地检测癌症遗传变异的实用方法。